沖縄の自然豊かな山と 海から生まれた水

 

 



以下は、T-RFLP(end-restriction fragment length polymorphism)解析の結果に基づいて、各OTU(Operational Taxonomy Unit)のピーク面積比から推定された微生物分類群を示すグラフです。

飲酒前の1回目(1か月)、間隔、2回目(1か月)の飲酒プロセスの変化が表示されます。。

目的

標本の核酸配列の16SrDNA(16SrRNA遺伝因子)部分のT-RFLPを分析し、得られたデータに基づいて標本の主要な分類群を簡単に推測し、
標本をクラスター分析で比較しました。

方法

1 DNA抽出
・抽出方法前処理、粗抽出:高橋ら1) 精製:PI-480およびNR-201(クラボウ、日本) ・吸光度の測定補足1 NanoDrop ND8000(Thermo Fisher Scientific、米国)DNA濃度(ng / ul)DNA純度(A260 / A280)

2 PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)
・プライマー(生物学的解析ソフトウェア)516F(6-FAM)-1510R(すべての真の細菌16SrDNA)2)3) ・PCR条件Nagashima et al.2)3)

3 制限酵素処理
制限制・制限酵素FastDigest BseLI(Bs / l)(Thermo Fisher Scientific、Thermo Fisher Scientific、米国) ・反応条件:37°C、10分

4 フラグメント分析
・分析装置ABI PRISM 3130 xl遺伝子分析システム (応用バイオシステム)

 

5動作分類単位(OTU)のピーク面積比と主要な分類群の推定
標本の最大T-RFLPがOTUとして割り当てられます。 Nagashima et al。の方法を使用2)3)測定された塩基対の最大数(bp)は異なりますが、特定の範囲内のピークは、主要な分類群が同じであるため、OTU(注1)として定義されます。 OTUが推定する分類群は、ヒトの腸内細菌叢データベースに基づいています(注2)。各OUTに対応する分類群のうち、クロストリジウムオーダーに含まれる分類群は、各クロストリジウムダスターごとに表示されます4)。さらに、なしおよび推定される複数のOTUはその他です。


6 クラスター分析
・解析ソフトウェアGene Maths(Applied Maths、BEL)
・クラスタリング手法UPGMA、距離関数、ピアソン積差相関係数(PPMCC)

※ 会社名および製品名は、日本やその他の国における商標または登録商標です。

結果
全体のピーク面積に対する各OTUのピーク面積比、および推定分類群を表1に示します。各推定分類群のピーク面積比のグラフを図1に示します。各サンプルのOTUピーク面積比を使用してクラスター分析を実行しました。結果を図2に示します。



表1 Bs / Iでの消化後の各OTUのピーク面積比(%)




表1 Bs / Iによる消化後の個々のOTUのピーク面積比(%)(続き)



図1各OTUのピーク面積比のT-RFLP分析結果。