沖繩的豐富性質 水從山和海出生

 

 



下列為依據T-RFLP(末端限制性片段長度多態化)分析結果各OTU(操作分類單元)峰面積比推定出的微生物分類群顯示圖表。 顯示了飲水前,第一次飲水(一個月),間歇期,第二次飲水(一個月)的過程變化。

目的

對標本的微生物群16SrDNA(16SrRNA遺傳因數)部分核酸序列的T-RFLP進行解析,根據所得資料對標本的主要分類群進行簡易推斷,並用聚類解析對標本之間進行比較。

方法

1 DNA萃取
・萃取方法 前處理,粗萃取:Takahashi et al  1) 精製:PI-480以及NR-201(日本Kurabo產業公司) ・吸光度測定 補充1 NanoDrop ND8000(美國賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific )DNA濃度 (ng/ul) DNA純度(A260/A280)

2 PCR(聚合酶鏈式反應)
・Primer(生物分析軟體) 516F(6-FAM)-1510R(全真正細菌16SrDNA) 2)3) ・PCR條件 Nagashima et al.  2)3)

3 限制酶处理
 ・限制酶   FastDigest BseLI(Bs/l)(美國賽默飛世爾科技Thermo Fisher Scientific ) ・反應條件 37°C ,10分鐘

4 斷片解析
・解析裝置 ABI PRISM 3130 xl Genetic Analyzer System        (美國應用生物系統公司Applied Biosystems)

 

5 操作分類單元(OTU)的峰面積比以及主要分類群的推定
將標本的T-RFLP最大值分配為OTU。用Nagashima等方法2)3)儘管測出的最大基體存在數堿基對(bp)有所不同,但因其由來的主要分類群相同,所以一定範圍內的峰值定義為OTU(注1)。對OTU推定出的分類群,以人體腸內菌群資料庫(注2)為依據。對應於各OUT的分類群中,包含在梭菌目(Clostridiales目)中的分類群則按各個梭菌群(Clostridium duster) 4)分別顯示。此外,None和推定菌群為複數的OTU則為Others


1. 本次使用的人體腸內菌群資料庫可以在本公司網頁



6 聚類解析
・ 解析軟體 Gene Maths(Applied Maths, BEL)
・ 聚類方法 UPGMA,距離函數,皮爾遜積差相關係數( PPMCC)

※ 公司名稱,產品名稱一般為在日本或各國家的商標或登記商標。

結果
相對於總體峰面積的各OTU的峰面積比,而推定出的分類群顯示為表1,各推定分類群的峰面積比的圖表顯示為圖1,用各標本OTU峰面積比進行聚類解析的結果則顯示為圖2。



表1 用Bs/I消化後的各OTU的峰面積比(%)




表1 用Bs/I消化後的個OTU的峰面積比(%) (續頁)



圖1 T-RFLP分析結果中各OTU的峰面積比。